摘要: 為研究乳酸菌體外對大腸桿菌的拮抗作用, 將3 株乳酸菌與2株大腸桿菌體外分別共培養觀察拮抗情況。結果顯示, 等量同時間接種, 96h內乳桿菌就將大腸桿菌全部抑殺; 乳酸菌比大腸桿菌早24 h 接種, 72 h內將大腸桿菌全部抑殺; 大腸桿菌比乳酸菌早24 h 接種, 在120 h 內也可全部被抑殺。3 株乳酸菌按一定比例復合, 會使拮抗的效果增強。

　　關鍵詞: 微生態、中藥、益生素、發酵、乳酸桿菌; 大腸桿菌; 拮抗作用

　　畜禽大腸桿菌病是畜牧業生產中常見傳染病之一, 對集約化養殖業危害極大。生產上由于大腸桿菌耐藥情況非常嚴重,給臨床治療此病帶來困難 。乳酸桿菌是畜禽腸道內主要的正常菌群, 具有抗感染、免疫刺激等許多生理功能。本試驗研究3株乳酸菌體外對大腸桿菌的拮抗作用, 以期為乳酸菌用于預防治療大腸桿菌病提供理論依據。

　　1   材料與方法

　　1.1 試驗材料

　　菌種: 乳酸乳桿菌( Lactobacillus lactis, L.l)、嗜酸乳桿菌( Lactobacillus acidophilus, L.a )、乳酸鏈球菌( Strep toccuelactis, S.l) 分離自健康雞腸道; 大腸桿菌1701株由發病雞場分離得到; 大腸桿菌TM 128株由江蘇省農業科學院惠贈。

　　培養基: 改良MRS液體培養基、普通瓊脂培養基、普通肉湯培養基。

　　1.2 試驗方法

　　將乳酸乳桿菌、乳酸鏈球菌、嗜酸乳桿菌、大腸桿菌分別在各自適宜的培養基內繁殖, 傳1代。取20 h培養物, 調整菌的濃度為10^7 CFU /mL。

　　取含改良MRS液體培養基試管4 支, 分別接種乳酸乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸鏈球菌及三者的混合物( 50:50 :2) 100uL, 同時再分別接種大腸桿菌1701或TM 128各100 uL; 設大腸桿菌單獨培養管作對照, 置恒溫培養箱37 培養。取培養24、48、72、96、120 h的培養液倒普通瓊脂平板, 檢查大腸桿菌存活情況, 記錄含活菌數。

　　取含改良MRS液體培養基試管4 支, 分別接種乳酸乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸鏈球菌及三者的混合物( 50:50: 2) 100 uL, 37 培養24 h后, 分別接種大腸桿菌各100 uL, 置恒溫培養箱37 再培養; 取培養24、48、72、96、120 h的培養液倒普通瓊脂平板, 檢查拮抗情況。

　　取含改良MRS液體培養基試管4支, 接種大腸桿菌各100 uL, 37 培養24 h后, 分別接種乳酸乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸鏈球菌及三者的混合物( 50:50:2) 100 uL, 37 ℃再培養; 取培養24、48、72、96、120 h的培養液倒普通瓊脂平板,檢查拮抗情況。

　　分別取上述各時間點培養物0.5 mL, 用滅菌生理鹽水做連續稀釋( 10^-1－ 10^-10 ) 后, 用滴注法點種于事先制作并烘

　　干表面水分的普通瓊脂平板上, 每滴100 uL, 每個稀釋度平

　　行3滴。經37℃ 24 h培養后分別計數大腸桿菌菌落數。

　　2   結果

　　( 1) 乳酸菌和大腸桿菌同時接種, 乳酸菌對大腸桿菌的拮抗作用結果見圖1和圖2。

　　　　圖2 同時接種乳酸菌對大腸桿菌TM 128拮抗結果

　　由圖1、2可以看出, 無論是試驗組還是對照組, 1701株與TM 128在前24 h都處于增殖期, 試驗組在24 h后, 細菌數開始下降, 而對照組, 則在48 h后, 開始出現下降, 但是試驗組明顯下降的更快。乳酸菌和大腸桿菌培養96 h后, 大腸桿菌全部被抑殺, 對照組培養120 h后, 大腸桿菌仍有存活。復合菌表現出比單一菌更強的拮抗能力。

　　( 2) 乳酸菌培養24 h 后接種大腸桿菌, 乳酸菌對大腸桿

　　菌的拮抗作用結果見圖3和圖4。

　　圖4 乳酸菌培養24 h后接種大腸桿菌TM 128的拮抗結果

　　結果表明, 當乳酸菌先培養24 h, 然后接種大腸桿菌共培養時無論是試驗組還是對照組在前24 h,大腸桿菌仍然處于增殖期, 但是試驗組大腸桿菌的增殖幅度明顯小于同時間等量接種結果, 說明了乳酸菌提前接種具有良好的拮抗效果。

　　( 3) 大腸桿菌先培養24 h后, 再接種乳酸菌對大腸桿菌的拮抗作用見圖5和圖6.

　　　圖6 大腸桿菌TM 128培養24 h后接種乳酸菌的拮抗結果

　　圖5、6可以看出, 當大腸桿菌先培養24 h, 然后接種乳酸菌共培養48 h后, 大腸桿菌的仍得到很好的抑制, 120 h后, 大腸桿菌可以完全被抑殺。

　　3 結論與討論

　　本試驗中, 3株乳酸菌對大腸桿菌1701、TM 128 株的生長增殖的拮抗作用, 均顯示了抑制效果。所得的結果可歸納為以下幾點:

　　①無論是禽致病性大腸桿菌1701, 還是豬致病性大腸桿菌TM 128, 在與包括L.a、L.l和S.l在內的乳酸菌混合培養時, 大腸桿菌的生長增殖均受到抑制, S.l對大腸桿菌的抑制效果最為明顯。這可能與S.l的生長增殖速度較其它兩株菌快有關, 生長增殖速度越快其培養基pH 下降速度越快, 培養基的pH 降低越明顯, 則抑制效果越強, 只是在抑制時間上有差異,這可能與所用菌株的生長增殖速度有關。

　?、趶秃先樗峋谵卓剐Ч蟽炗趩我痪? 說明某些菌種復合可以形成較強的微生態制劑。機理不明, 可能因為不同菌株在生長增殖過程中起到了相互促進增殖的作用; 或者由于其中的某一菌株可以促進另一菌株產生抗菌素一類的物質。

　　③不管是同時接種還是先后不同時間接種, 乳酸菌對大腸桿菌均有一定的抑制效果。但明顯乳酸菌提前24 h 接種的效果要好的多, 主要由于乳酸菌經過24 h的培養, 在局部形成了優勢微生物菌群, 可以很好的抑制大腸桿菌的生長增殖;而大腸桿菌提前24 h接種, 仍具有一定的拮抗效果, 只是拮抗的時間要到120 h。