中國是世界水產養殖第一大國，據《中國漁業統計年鑒2021》報告，我國水產養殖總產量從1978年的233萬t增加到2020年的5224萬t。然而，在水產養殖快速發展的同時，養殖魚類疾病暴發的頻率也有所增加，給養殖戶帶來了巨大的經濟損失。魚類的生長發育大致可分為胚胎期、仔魚、稚魚、幼魚和成魚5個階段。幼魚階段是魚類養殖周期的最初階段，根據魚類物種不同，該發育時期持續的時間為1～3個月。與成魚相比，幼魚的免疫系統尚未發育完全，只能依靠先天性免疫系統防御入侵的病原體，這也導致養殖水體和活體飼料都可能成為致病菌的潛在載體，引發幼魚較高的發病率和死亡率。因此，提高幼魚的免疫力是水產養殖成功的關鍵因素之一。
　　“益生菌”一詞的使用始于20世紀70年代，它源于希臘語中的“生命”一詞。2001年，聯合國糧食及農業組織和世界衛生組織將“益生菌”定義為“當攝入足夠數量時，對宿主健康產生益處的活性微生物”。近年來，隨著益生菌概念的不斷發展及其機制研究的不斷深入，益生菌已被廣泛用于水產養殖產業。由于具有安全有效的特點，益生菌作為抗生素的替代品在水產養殖尤其是魚貝類幼體的養殖中展現出良好的前景。通過水體添加或者飼料添加，益生菌能夠抵達幼魚腸道,與腸道菌群相互作用并調節幼魚的生長發育和免疫功能(表 1)。然而，益生菌對幼魚健康的調控機制還需進行深入探索。本文旨在梳理近年來益生菌在魚體胚胎期至成魚前的發育階段所發揮的有益作用，討論益生菌在幼魚養殖中的應用情況、存在的問題以及未來的發展方向。
　　1 魚類不同生長階段的微生物組成
　　腸道微生物是魚體的重要組成部分，與其他生物一樣，腸道微生物的組成隨著魚體發育階段的變化而變化。但是與陸生動物不同的是，水體微生物對于幼魚腸道菌群的定殖具有更加顯著的影響。Bates等發現在斑馬魚幼魚中，水體中常見的氣單胞菌屬和假單胞菌屬(Pseudomonas)是幼魚腸道的優勢物種。Xiao等的研究中，12～20日齡的斑馬魚腸道中弧菌屬和氣單胞菌科(Aeromonadaceae)的豐度較高，累計占微生物總豐度的50%;27～42日齡，鄰單胞菌屬(Plesiomonas)占據優勢;56-98日齡，斑馬魚腸道中鯨桿菌屬(Cetobacterium)豐度顯著增加至40%，而氣單胞菌科下降至8.2%。這些結果說明斑馬魚的腸道微生物組成隨著發育階段的不同而出現差異，早期魚腸道中以水體優勢菌為主，而隨著魚體的營養攝取，斑馬魚腸道菌群產生演替。最近的一項研究發現，斑馬魚腸道中微生物的相互作用和穩定性通常隨著宿主的發育而增加，這可能是因為隨著斑馬魚免疫系統的不斷發育，腸道內微生物可定殖的空間增加，成年斑馬魚中微生物可用的營養物質更穩定等因素造成的。目前該方面的研究主要關注魚體不同發育階段微生物的演替變化規律。結合高通量測序技術以及相關性分析對不同發育階段的魚體腸道微生物進行大規模統計，有助于挖掘與魚體發育密切相關的腸道微生物種群，而針對微生物在宿主發育中的調控作用還需更多證據。
　　表1 近10年幼魚養殖中的常用益生菌及其功效
　　

　　2 益生菌對幼魚生長發育及健康的影響
　　近年來的研究表明，益生菌對幼魚生長發育及健康具有重要作用(圖1)，包括增強幼魚的抗病力和免疫力、提高幼魚抵抗水體污染物的能力、促進幼魚對營養成分的攝取、調節幼魚腸道菌群和增強腸道生理功能。

　　2.1 增強幼魚的抗病力和免疫力
　　水產養殖中集約化程度的增加和水質的惡化導致病原體在養殖水體中迅速繁殖和傳播，增加了魚類患病的風險。由于抗病性較差，幼魚對于水環境中病原菌的感染更加敏感。大量研究表明，益生菌可以通過直接抑菌、降低致病菌毒力和增強宿主固有免疫等方式來提高幼魚抗病力和免疫力，幫助幼魚抵抗病原體感染。
　　Touraki等將植物乳桿菌添加至飼料中飼喂舌齒鱸幼魚，在鰻弧菌攻毒實驗中，經植物乳桿菌處理的舌齒鱸幼魚死亡率為14%，而未經益生菌處理的幼魚死亡率高達54%，說明植物乳桿菌可以有效抵抗鰻弧菌的侵染。Samat等發現抱川芽孢桿菌S2能在體外抑制無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)和嗜水氣單胞菌的生長。Dey等的研究發現，融合魏斯氏菌DD_A7在體外具有抗菌和免疫刺激活性。用融合魏斯氏菌DD_A7對斑馬魚幼魚進行12h預處理可有效降低致病菌株大腸桿菌(Escherichia coli) O157：H7的毒力。目前的研究主要集中于評估不同益生菌在提高幼魚抗病性方面的效果，但是對于益生菌發揮作用的關鍵效應分子及其抵抗病原體的具體分子機制還不明確，而益生效應分子或抗菌機制的解析將會對幼魚養殖中抗菌策略的開發提供重要思路。
　　成魚的免疫系統包括固有免疫和適應性免疫，二者協同作用以幫助魚體抵抗病原菌的入侵。在幼魚發育的早期階段，其適應性免疫系統尚未成熟，在此期間幼魚主要依靠固有免疫系統作為抵抗病毒和細菌感染的第一道防線。固有免疫系統通過模式識別受體識別包括脂多糖(LPS)、肽聚糖、核酸和鞭毛蛋白在內的微生物相關分子模式，誘導信號級聯反應，產生細胞因子、趨化因子和其他效應分子，從而激活宿主的免疫反應。已有多數研究表明，益生菌可以通過增強幼魚的固有免疫應答來幫助幼魚抵抗多種病原菌的侵染。研究者用融合魏斯氏菌DD_A7粉末對斑馬魚幼魚進行12h預處理，發現益生菌預處理使幼魚中炎癥反應相關基因NF-κB(nuclear factor-κB)和 TNF-α (tumor necrosis factor-α)的表達顯著下調。Xia等分別用低濃度和高濃度的乳酸乳球菌JCM5805連續處理羅非魚幼魚15d，發現高濃度JCM5805處理組幼魚在第5天和第10天時TLR9(toll-like receptor 9)、IRF7(interferon regulatoryfactor 7)、MyD88 (myeloid differentiation primary response gene 88)和 IFNα(interferonα)表達均顯著增加，而在低濃度益生菌處理組，這些基因的表達未出現顯著差異。在停止益生菌處理1個月后，各組之間上述基因的表達沒有差異。這些結果說明，TLR -Myd88 途徑的激活和炎癥因子的表達調控是益生菌增強幼魚免疫防御的機制之一，而益生菌的添加濃度和添加時間直接影響益生菌的作用效果。Caruffo等的研究中，用鰻弧菌感染斑馬魚幼魚后，促炎細胞因子IL-1β(interleukin-1β)、TNF-a、補體C3(complement3)的表達顯著上調，而益生菌漢遜德巴利酵母97和解脂亞羅酵母(Yarrowia lypolitica)242單獨處理幼魚后則有效抑制了IL-1β、TNF-α、補體C3的表達。Jurado等發現接受益生菌腐敗希瓦氏菌Pdp11處理的塞內加爾鰨幼魚中溶菌酶的活性顯著升高，且補體激活的旁路途徑活性顯著增強。溶菌酶活性的高低反映了魚體先天性免疫應答的強弱，與魚體的年齡、大小及營養狀況等因素有關，同時溶菌酶對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌也顯示出不同的抗菌活性。上述研究表明，固有免疫系統的激活是益生菌增強幼魚免疫力的主要途徑，同時補體途徑等其他免疫相關通路也參與了益生菌對幼魚免疫系統的調節，但是關于益生菌的添加對適應性免疫系統的發育和成熟是否存在長期的影響還鮮有報道。
　　2.2  提高幼魚抵抗水體污染物的能力
　　水環境污染物也是影響幼魚生長的一大因素，水環境中多種污染物對養殖動物的生長發育和健康造成了嚴重威脅。近年來，研究表明益生菌的應用可有效提高幼魚對水體環境污染物的耐受性。Liu等將斑馬魚幼魚暴露于水體污染物全氟丁烷磺酸(perfluorobutanesulfonate，PFBS)，并用鼠李糖乳桿菌LGG處理幼魚，結果顯示益生菌處理的斑馬魚幼魚的體長顯著增加。通過蛋白質組學分析，研究者發現益生菌的添加可能緩解了PFBS 引起的能量代謝紊亂，從而使能量更多地用于幼魚生長。同樣的，Hu等通過代謝組和轉錄組分析，發現益生菌驅動了暴露于PFBS的斑馬魚幼魚代謝譜的改變，其中，與DNA甲基化相關的代謝物下調，與DNA去甲基化相關的基因表達上調。DNA甲基化標記的丟失導致基因轉錄和蛋白質表達過程的增強，這可能是益生菌緩解PFBS發育毒性的機制。Sun 等阿則發現在PFBS暴露的情況下，益生菌可能通過調控下丘腦-垂體-甲狀腺軸和下丘腦-垂體-腎間軸協同促進斑馬魚幼魚的生長。
　　從現有的研究來看，微生物可以通過直接吸附或降解等方式來降低水體中污染物的濃度，從而保護幼魚免受污染物脅迫。Mohite等發現漢氏葡糖酸醋桿菌(Gluconoacetobacter hansenii) 產生的細菌纖維素能夠有效吸附鉛、鎘、鎳等不可降解的潛在有毒元素(potentially toxic elements,PTEs)。革蘭氏陽性益生菌如乳桿菌屬、雙歧桿菌屬細菌的細胞壁具有多種官能團，能夠提供去除PTEs的硫酸鹽、磷酸鹽、羧基和氨基等活性位點，這些官能團能與重金屬離子結合，達到降低毒物濃度的效果，使這類細菌具有良好的PTEs去除能力。另一方面，研究者發現枯草芽孢桿菌和羅伊氏乳桿菌(L. reuteri)對環境化學污染物雙酚A具有較高的降解能力，有效降低培養基中雙酚A的濃度。雖然益生菌對于水體污染物緩解的作用不大相同，但通過解析微生物中具有特異性污染物降解能力的元件，并利用合成生物學技術改造益生菌，對于擴大益生菌在幼魚養殖中的應用范圍有積極作用。
　　2.3 促進幼魚對營養的攝取
　　益生菌的施用會對魚類攝取營養的過程產生一定影響，在成魚上，這些作用包括提高飼料消化率、改善消化酶活性、調控糖脂代謝等。在幼魚上的研究也表明，益生菌可以通過促進消化酶活性和攝食來增強幼魚對飼料中營養成分的攝取，從而提高幼魚的生長性能。幼魚的腸道微生物組中有一些能夠分泌纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、幾丁質酶和脂肪酶等的微生物，這些酶在飼料分解利用中發揮關鍵作用。Yin 等用含丁酸梭菌的飼料飼喂大黃魚幼魚，發現益生菌的補充顯著提高了幼魚脂肪酶和亮氨酸氨基肽酶的活性，表明益生菌有助于改善幼魚的消化能力，促進幼魚消化功能的成熟。Hamza等的研究同樣報道了兩株益生菌(普氏枝芽胞桿菌和摩加夫芽胞桿菌)對舌齒鱸幼魚胰蛋白酶、脂肪酶以及亮氨酸氨基肽酶活性的增強作用。
　　研究者以尼羅羅非魚幼魚為實驗模型，將鼠李糖乳桿菌IMC501添加在飼料中以飼喂幼魚，結果表明，補充益生菌組的幼魚采食量顯著增加，同時促食欲激素的基因表達上調。由于幼魚體積較小，益生菌對于幼魚營養攝入的研究證據也僅停留在幼魚的采食量和基因表達等表觀水平。Rawls 等通過光學顯微鏡和透射電鏡對受精后6d的斑馬魚進行了仔細的形態學觀察，同時轉錄組分析表明微生物在腸道的定殖促進斑馬魚幼魚法尼基二磷酸合酶(recombinant farnesyl diphosphate synthase，FDPS)和載脂蛋白B的表達，這也說明，微生物在斑馬魚幼魚脂質代謝調控中發揮重要作用。目前關于益生菌促進幼魚生長的分子機制研究還較少，但在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)上已有較為深入的研究。Storelli等從果蠅腸道中分離到一株植物乳桿菌，將該菌添加到果蠅培養基中，發現植物乳桿菌能夠促進果蠅幼蟲對培養基中蛋白質的同化作用，從而增加支鏈氨基酸的水平，刺激雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)的活性，進而通過上調類固醇激素蛻化激素(ecdysone，Ecd)和果蠅胰島素樣肽(drosophilainsulin like peptide,dILP)的表達來縮短果蠅幼蟲羽化的時間、提高幼蟲的生長速率。Matos等通過轉座子在植物乳桿菌中隨機插入片段，發現植物乳桿菌細胞壁中磷壁酸的D-丙氨?；瘜χ参锶闂U菌介導的促生長作用是不可或缺的。這些研究表明，益生菌能夠通過促進飼料中營養素的同化和刺激生長軸的活性來促進動物幼年階段的生長發育，其中，益生菌細胞壁組分對于益生菌的促生長作用非常重要。果蠅中的研究也說明，通過對益生菌進行的某些基因進行敲除或者過表達，對于揭示益生菌促進幼魚生長發育的機制具有重要作用。
　　2.4 調節幼魚腸道微生物
　　健康的腸道微生態是幼魚正常生長發育的重要因素。大量證據表明，宿主-微生物相互作用也有可能成為幼魚生存能力差、存活率低的主要原因。益生菌的添加能夠有效調節幼魚的腸道微生物組成。Falcinelli等的研究發現，與對照組相比，用鼠李糖乳桿菌處理斑馬魚幼魚6d后，其腸道微生物組成改變，厚壁菌門(Firmicutes)豐度增加，放線菌門(Actinobacteria)豐度降低。Yin等的研究中，飼喂丁酸梭菌的大黃魚幼魚腸道微生物組成發生變化，其中丁酸梭菌的豐度大幅增加，而包括假單胞菌目(Pseudomonadales)在內的潛在致病菌的豐度顯著降低，同時腸道菌群的α多樣性顯著降低，說明益生菌可以有效調節幼魚腸道菌群，且益生菌引起的腸道菌群變化與幼魚的生長和代謝密切相關。Giatsis等的研究發現，暴露于枯草芽孢桿菌水體環境中7d的羅非魚幼魚腸道菌群發生顯著變化，且益生菌處理組羅非魚幼魚的個體間差異更小，說明在魚類早期發育階段施用益生菌有利于不同個體間腸道菌群的趨同。Xia等叫發現施用108CFU/mL乳酸乳球菌JCM5805的羅非魚幼魚腸道菌群與對照組相比存在顯著差異，且在停用益生菌后該差異仍然存在，腸道菌群的變化通過TLR7/TLR9-Myd88 信號通路使IFN-α的表達顯著上調，最終增強了羅非魚幼魚的抗病能力。這些研究說明，益生菌能夠引起幼魚的腸道微生物組發生變化，這種變化可能持續一段時間并顯著影響幼魚的健康狀態，同時益生菌還通過降低腸道致病菌豐度、調節免疫相關基因表達增強幼魚的抗病能力。雖然通過高通量測序技術，可以較為直接地反映魚腸道微生物的組成情況，但是針對腸道微生物功能的解析目前還需要開展大量的工作。我們要明確對于在門水平上的微生物變化只能作為參考，但難以得出明確的結論，微生物的功能解析要以菌株為單位;其次，微生物功能解析要關注因果性而不僅僅是相關性，所以無菌或限菌模型的構建以及單一變量下微生物的功能分析都是必要且重要的。
　　2.5 調節幼魚腸道生理功能
　　腸道功能包括轉運和消化食物、吸收營養、進行排泄等，因此腸道細胞的增殖和腸道功能的發育對機體的生長至關重要。脊椎動物消化道的發育受到腸道微生物組成的顯著影響。腸上皮細胞是腸道屏障的重要組成部分，研究證實，魚類腸道微生物促進上皮細胞的分化和成熟。腸道微生物的缺失會導致幼魚腸道發育受損，從而影響魚體對營養的吸收和同化。Rawls等證明斑馬魚幼魚的腸道微生物強烈影響腸上皮細胞的更新和腸細胞的形態，定量5-溴脫氧尿苷標記顯示受精后6d的無菌斑馬魚腸上皮細胞的增殖率顯著降低。同時，Bates等的研究發現，腸道微生物的缺乏阻礙了斑馬魚腸道上皮細胞的分化和成熟，8日齡的無菌斑馬魚中腸道堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)的活性顯著降低，且大豆凝集素(soybean agglutinin，SBA)和凝集素(Griffonia simplicifolia isolectinB4)的表達模式失常，而這2種糖綴合物的正常表達是腸上皮成熟的標志之一。另外，研究者給受精后8d的斑馬魚幼魚飼喂辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)溶液以觀察其對蛋白質的攝取能力，通過HRP染色表征斑馬魚對HRP的攝取情況，結果發現在無菌斑馬魚幼魚腸道中幾乎未觀察到HRP染色，而微生物定殖的斑馬魚表現出正常的HRP吸收，說明腸道微生物對蛋白質大分子的攝取是必需的。Chen等用108CFU/mL的乳雙歧桿菌BL-99處理5日齡斑馬魚幼魚，通過熒光立體顯微鏡觀察便秘模型斑馬魚對熒光染料的排泄能力，發現BL-99的處理能夠顯著促進排泄受限的幼魚的腸道蠕動。上述研究說明，腸道微生物不僅刺激腸細胞本身的分化和增殖，還會對腸道功能如攝取蛋白的能力、排泄能力造成影響。Padeniya等將斑馬魚幼魚置于含有19株活乳酸菌的益生菌溶液的培養皿中培養，發現益生菌處理后的斑馬魚幼魚胃腸道的線粒體活性顯著增加，反映了幼魚初始代謝功能的發生和發展。Yin等的研究發現，攝食了飼料中補充丁酸梭菌的大黃魚幼魚腸道絨毛和腸細胞的高度顯著高于不加菌的對照組，同時腸上皮細胞增殖和分化相關基因如緊密連接蛋白基因zo-2和鳥氨酸脫羧酶odc的表達顯著上調。這些結果說明，益生菌在有效黏附于幼魚腸道的條件下，通過刺激腸上皮細胞增殖相關基因的表達促進腸上皮的增殖和分化，同時通過促進腸道蠕動、增強腸道代謝活動等機制來促進幼魚腸道功能的發育。然而，目前關于益生菌如何影響腸道功能的研究大多局限在腸道消化酶活性以及炎癥和腸道屏障等相關基因表達的檢測。在研究方法和技術手段上，體內實驗和體外實驗對于益生菌的功能評價都是至關重要的。在成魚上，尤斯室和異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記的葡聚糖已經用于在體外和體內檢測魚體的腸道通透性。在幼魚中，熒光標記底物的使用及觀察對于評價益生菌調節幼魚腸道功能具有較強的可行性。
　　3 小結和展望
　　綜上，在幼魚階段施用益生菌能夠幫助其抵抗外界環境的壓力、增加營養攝取、增強免疫力和抗病力、促進腸上皮細胞的分化和成熟以及調節腸道菌群的平衡。益生菌對幼魚的影響是多方面的，但目前的相關研究更多地關注益生菌施用所引起的幼魚表型的變化，而有關益生菌作用的分子機制還需更加系統和深入地研究。隨著組學和生物信息學的快速發展，我們可以利用這些技術評估益生菌對幼魚基因、代謝和腸道微生物的整體影響。除了在體實驗，體外實驗可能更有助于解析益生菌本身的功能。通過轉座子誘變、基因敲除等手段對益生菌進行基因工程改造，從而獲得某些細菌功能或組分缺陷的菌株，可能有利于明確益生菌中發揮益生作用的效應分子，這些研究手段的完善和分子機制的深入研究對幼魚養殖實踐中益生菌的施用和抗菌物質的開發至關重要。
　　目前已有大量研究證實益生菌對魚類早期發育具有明顯的促進作用，但是這些研究大多是在實驗室水平證明了益生菌對幼魚的有益影響。實際上，對于大規模幼魚養殖實踐中的益生菌施用還需考慮種類、劑量、效用持續時間等問題。例如，同一株益生菌在不同種魚類中的作用可能不同，同一菌株不同濃度的添加可能對幼魚的影響呈現出劑量效應。水體添加和飼料添加也會在很大程度上影響益生菌的施用效果。此外，不同益生菌聯用可顯著改善幼魚的生長和存活率，但在大多數研究中，益生菌的復配是根據其體外抗菌活性進行選擇的，這種施用策略可能限制了益生菌對幼魚有益作用的最大化。
　　目前關于益生菌對幼魚發育影響的研究主要關注其對魚體的益生作用，但是益生菌的施用無疑會影響幼魚生存環境中的微生物群落，這對整個養殖生態系統是否存在負面影響也值得關注，探索綠色、可持續的益生菌施用策略將有助于緩解其可能帶來的生態環境失調。從長遠來看，益生菌對幼魚生長發育的有益作用會受到水產養殖業越來越多的關注，相關研究的持續深入對改善水產養殖中的幼魚健康、提高魚苗產量具有重要意義。