隨著我國畜牧業迅速發展，家禽養殖規模不斷擴大，肉雞占家禽養殖較大比重。大腸桿菌是肉雞生產中最為常見的致病菌，其危害大、傳播性強，不僅危害家禽.還會傳染人類，是常見的細菌性人畜共患病。在臨床使用當中，抗生素對治療禽大腸桿菌疾病有著明顯的效果。在肉雞養殖中，不合理使用抗生素，導致的濫用問題也日趨嚴重，長期大量濫用抗生素導致免疫力下降腸道菌群失調，更易感染病原菌。根據中華人民共和國農業農村部《2021年中國獸用抗榮藥使用情況報告數據顯示，2020年全年中國大陸境內使用的抗菌藥總量為32 776.298 t。長期使用廣譜類抗生素會導致病原菌耐藥性增強，藥物本身還會對畜禽機體產生毒副作用，損傷肝臟功能導致雞急性中毒死亡，影響腎功能，損傷腎小管引起腎功能代謝不全。中國農業部發布《全國獸用抗菌藥使用減量化行動方案(2021-2025年)》，提出到2025年底規模養殖場要做到規范科學用藥，讓畜禽產品更安全。

　　益生菌是一類對動物機體有益的活性微生物。通過在動物胃腸道生存定植，不斷生長繁殖，產生一些具有較強生理活性的代謝產物。如酶類，可以促進食物消化，增加營養物質吸收;有機酸，有抑制病原微生物生長或殺死病原微生物的作用;一些免疫物質，可以提高機體免疫力。益生菌具有的抑制有害菌生長，調節機體免疫功能，促進營養物質消化吸收的生理功能已經過科學證明，能對腸道起有益作用。益生菌制劑在養禽業提高肉雞生產性能、提高蛋雞產蛋性能上早有應用。肉雞上常用的益生菌有芽孢桿菌、乳酸桿菌、酵母菌、雙歧桿菌等，但使用效果參差不齊，有待進一步優化產品性能。

　　本試驗使用自主分離的禽源糞腸球菌、枯草芽孢桿菌，通過功能性和適應性考量，從體外進行抑菌試驗，后制成復合益生菌劑，飼喂肉雞，檢測體內效果。尋求能夠抑制常見致病菌的益生菌作為生物制劑以代替抗生素使用，為益生菌在肉雞養殖上的應用提供參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 菌種來源

　　糞腸球菌和枯草芽孢桿菌由江蘇農林職業技術學院畜牧獸醫學院益生菌團隊分離獲得，保藏于中國普通微生物保藏中心，保藏編號分別為CGMCC25043和CGMCC14246.禽源大腸桿菌由南京農業大學動物醫學院畜禽營養代謝病教研組提供，為大腸桿菌標準株CGM-CC25922.

　　1.2 菌劑制備

　　分別用MRS 培養基、酵母膏胨葡萄糖培養基(YEPD)、肉湯培養基，將糞腸球菌、枯草芽孢桿菌和禽源大腸桿菌菌種活化。后擴增培養，將培養液按 10倍比稀釋，計數發酵液中的活菌數量。糞腸球菌、枯草芽孢桿菌和禽源大腸桿菌的活菌數量，分別達到4×109、2×109、3×109CFU/ml后至4℃冰箱備用。

　　1.3 益生菌與禽源大腸桿菌共培養

　　分別取糞腸球菌、枯草芽孢桿菌和禽源大腸桿菌發酵菌液，用1%的蛋白胨生理鹽水稀釋至10⁹CFU/ml，備用。

　　各取100μl稀釋后的糞腸球菌和禽源大腸桿菌，分別接種到5ml肉湯培養基中。同時各取100μl稀釋后的枯草芽孢桿菌與大腸桿菌共培養，在同等條件下以大腸桿菌單獨培養作為空白對照，至37℃培養。分別于培養后的12、24、36、48和96h取100μ1共培養液，采用活菌計數大腸桿菌數量，將培養液按10倍比稀釋，分別涂布于伊紅美蘭瓊脂平板上(EMB)，37℃培養18h后計數大腸桿菌菌落數。

　　1.4 益生菌發酵濾液的制備

　　分別取糞腸球菌、枯草芽孢桿菌發酵菌液3ml，1000rpm/min 離心10min后，取100μl上清液。再用0.45μm濾器過濾除去菌體，收集濾液即為發酵濾液。使用牛津杯法，開展益生菌抑制大腸桿菌試驗。

　　1.5 動物與分組

　　將300只1日齡的黃羽肉雞40.69g±1.27g隨機分成3組，每組5個重復，每個重復20只。分成對照組、復合益生菌組和抗生素組(黃霉素組)。

　　復合益生菌組日糧配置：將發酵后的糞腸球菌、枯草芽孢桿菌按體積比1∶1混勻。取300ml混合菌液，與100kg基礎日糧混合均勻，制得益生菌組日糧?？股亟M日糧配置：取基礎日糧100kg與0.4g黃霉素粉劑混合均勻，制成4mg/kg濃度的抗生素日糧?；A日糧配方見表 1.

　　表1基礎日糧組成和營養水平

　　1.6 飼養管理

　　試驗期共48d，分為前期(1～24d)和后期(25～48d)2個飼養階段，自由采食和自由飲水，24h光照，溫度控制在24.0～30.5℃。飼養管理按雞場的常規免疫程序和管理制度進行。

　　1.7 測定指標及方法

　　1.7.1 血漿樣品制備

　　整個飼養試驗結束后，禁食12h之后，隨機從每個重復抽取6只雞，頸靜脈放血屠宰。血漿樣品制備:采用翅靜脈采血，用含肝素鈉的抗凝試管盛取血液，后用3000rpm/min離心12min，其上清液分裝于1.5ml Eppendorf管中，置-20℃低溫冰箱中保存，以備血漿抗氧化指標的檢測。

　　1.7.2 抗氧化指標

　　血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶活性(SOD)、總抗氧化能力。采用試劑盒檢測各項指標，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

　　1.7.3 腸道菌群

　　于試驗第56天，在每個重復隨機選擇2只雞進行屠宰，屠宰雞均取一側盲腸放人液氮中，以備微生物測定。測定時，在超凈臺中稱取盲腸內容物1g，加入9ml滅菌生理鹽水，充分搖勻，進行逐級10倍稀釋，取合適梯度的細菌稀釋液100ml接種到麥康凱培養基上，用于計數大腸桿菌;使用MRS固體培養基計數樣品總乳酸菌。后將稀釋的樣品于85℃，放置30 min以除去其他細菌，后取100μl涂布至YPD 固體培養基上，計數總芽孢桿菌。平板放置培養箱中培養18～20h后進行計數菌落數量。

　　1.8 統計分析

　　試驗數據用SPSS17.0軟件進行統計分析。差異顯著者進行Dμ-ncan氏法進行多重比較以“平均值±標準差”表示。

　　2 結果

　　2.1 益生菌與禽源大腸桿菌共培養

　　表2 不同培養時間的大腸桿菌數量CFU/ml

　　注:同行肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P <0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，無字母肩標表示差異不顯著(P >0.05)，下同。

　　結果見表2.糞腸球菌與大腸桿菌共培養12 h后，其中的大腸桿菌數量從對照組的2×10⁹CFU/ml降低到2×10⁵CFU/ml，至24h后，培養液中的大腸桿菌數量降低到5×10²CFU/ml，至36h后培養液中檢測不出大腸桿菌數?？莶菅挎邨U菌與大腸桿菌共培養12h后，其中的大腸桿菌數量對照組的降低到6.5×106CFU/ml，至24h后，培養液中的大腸桿菌數量降低到1×10⁵CFU/ml，至36h降至4×10³CFU/ml，至48h后培養液中檢測不出大腸桿菌數，均極顯著低于對照組(P<0.01)。

　　2.2 牛津杯法檢測抑菌效果

　　采用牛津杯法檢測抑制禽源大腸桿菌的效果，在添加糞腸球菌和枯草芽孢桿菌發酵濾液的牛津杯周圍出現明顯的抑菌圈，直徑分別為(20.12±0.45) (15.54±0.45)mm。見圖1、圖2.對照組為生理鹽水，無抑菌圈出現。

　　2.3 益生菌對雞血液抗氧化力的影響

　　結果見表3.雞飼喂益生菌48天后，與對照組相比血漿中MDA含量顯著下降(P<0.05)，總抗氧化能力水平得到一定提升(P<0.05)。與對照組相比，SOD活力沒有差異性(P>0.05)?？股亟M血清抗氧化能力顯著，MDA水平顯著低于對照組(P<0.05)，與益生菌組沒有顯著差異(P>0.05);總抗氧化能力顯著高于對照組(P<0.05)，與益生菌組沒有顯著差異(P>0.05)。

　　表3 添加益生菌對肉雞血漿抗氧化力的影響

　　2.4 枯草芽孢桿菌對雞腸道菌群的影響

　　在飼喂枯草芽孢桿菌后48天，盲腸菌群結果見表4所示，與對照組相比，益生菌組雞盲腸內容物中大腸桿菌數量顯著下降，乳酸菌和總芽孢桿菌數量顯著高于對照組(P<0.01)。而抗生素組盲腸大腸桿菌、乳酸菌和總芽孢桿菌數量皆極顯著低干對照組(P<0.01)。

　　表4添加益生菌對肉雞盲腸菌群的影響結果

　　3 討論

　　3.1 益生菌對大腸桿菌的抑制

　　研究報道糞腸球菌、凝結芽抱桿菌、枯草芽孢桿菌在生長穩定期就能產生抑菌物質，其對革蘭氏陽性菌，尤其是對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、艱難梭菌有很好的抑制作用。糞腸球菌和枯草芽孢桿菌會產生細菌素，并能通過營養競爭的方式來抑制大腸桿菌的生長，對有害微生物起抑制和殺滅作用。同時糞腸球菌和枯草芽孢桿菌在菌體的生長過程中能夠產生短鏈有機酸等揮發性脂肪酸，這些酸類物質能降低動物腸道pH值，可有效抑制大腸桿菌的生長。

　　3.2 對肉雞抗氧化的影響

　　活細胞抗氧化系統的第一道防線負責制止自由基的生成和脂質過氧化，過量的自由基可損傷蛋白質、核酸等生物大分子物質，并產生大量的MDA，造成組織細胞損傷，影響機體內環境的相對穩定，從而誘發許多疾病的發生。通過測定機體MDA含量、SOD酶活力和總抗氧化能力水平可以反映機體抗氧化水平。本實驗結果表明，枯草芽孢桿菌會對機體的總抗氧化能力和MDA含量產生影響，而對SOD酶活力沒有影響，與翟召靜、楊曦報道一致。錳和銅為SOD蛋白酶的活性中心元素，其可能機制為芽孢桿菌不會增強機體錳和銅的吸收，對SOD酶活力的影響不顯著。

　　3.3 對盲腸微生物區系的影響

　　羅敏、李紅斌研究表明，給肉雞補充糞腸球菌和芽孢桿菌可顯著降低盲腸菌群中產氣莢膜桿菌及其他有害菌的數量。糞腸球菌和芽孢桿菌屬于我國農業部規定的飼用益生菌，可改善腸道內環境;兩株菌自身具有生長力強，繁殖快等優點，在生長時消耗腸道內的氧氣，降低氧含量形成相對厭氧環境，有利于厭氧型細菌的生長，如乳酸菌和雙歧桿菌，使得腸道內乳酸菌和雙歧桿菌等有益菌的數量高于對照組，進一步優化了腸道內的菌群結構，抑制了致病性大腸桿菌等需氧菌的數量。正常微生物群有序地定植于黏膜或細胞上皮形成膜狀屏障物，而有害菌只有定植于黏膜上皮的某些位點，才能對機體發揮毒性作用，益生菌能夠與致病菌競爭黏膜上皮位點，一定程度上阻止病原菌附著。糞腸球菌和枯草芽孢桿菌具有競爭性的抑制致病菌附著的能力。從而降低了雞盲腸內大腸桿菌在腸道定植或移位至小腸的數量，有效保護肉雞腸道健康。

　　4 結論

　　糞腸球菌和枯草芽孢桿菌在體外可抑制禽大腸桿菌的生長，在體內可以提高機體抗氧化能力，改善盲腸微生物區系，從而抑制盲腸內大腸桿菌的數量。綜上糞腸球菌和枯草芽孢桿菌可有效抑制禽源大腸桿菌的生長，作為益生菌制劑可用于肉雞養殖。

　　參考文獻：略。