1、 原理

　　凱氏法測定試樣中的含氮量，即在催化劑作用下，用硫酸破壞有機物，使含氮物轉化成硫酸銨。加入強堿進行蒸餾使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，測出氮含量，將結果乘以換算系數6.25，計算出粗蛋白含量。

　　2、試劑

　　2.1 硫酸（GB 625）：化學純，含量為98％，無氮。

　　2.2 混合催化劑：0.4g硫酸銅，5個結晶水（GB 665），6g硫酸鉀（HG 3—920）或硫酸鈉（HG 3—908），均為化學純，磨碎混勻。

　　2.3 氫氧化鈉（GB 629）：化學純，40％水溶液（m/V）。

　　2.4 硼酸（GB 628）：化學純，2％水溶液（m/V）。

　　2.5 混合指示劑：甲基紅（HG 3—958）0.1％乙醇溶液，溴甲酚綠（HG 3—1220）0.5％乙醇溶液，兩溶液等體積混合，在陰涼處保存期為三個月。

　　2.6 鹽酸標準溶液：鄰苯二甲酸氫鉀法標定，按GB 601制備。

　　2.6.1 鹽酸標準溶液：c（HCl）=0.1mol/L。8.3mL鹽酸（GB 622，分析純），注入 1 000mL蒸餾水中。

　　2.6.2 鹽酸標準溶液：c（HCl）=0.02mol/L。1.67mL鹽酸（GB 622，分析純），注入1 000mL蒸餾水中。

　　2.7 蔗糖（HG 3—1001）：分析純。

　　2.8 硫酸銨（GB 1396）：分析純，干燥。

　　2.9 硼酸吸收液：1％硼酸水溶液1 000mL，加入0.1％溴甲酚綠乙醇溶液10mL，0.1％甲基紅乙醇溶液7mL，4％氫氧化鈉水溶液0.5mL，混合，置陰涼處保存期為一個月（全自動程序用）。

　　3、 儀器設備

　　3.1 實驗室用樣品粉碎機或研缽。

　　3.2 分樣篩：孔徑0.45mm（40目）。

　　3.3 分析天平：感量0.0001g。

　　3.4 消煮爐或電爐。

　　3.5 滴定管：酸式，10、25mL。

　　3.6 凱氏燒瓶：250mL。

　　3.7 凱氏蒸餾裝置：半微量水蒸氣蒸餾式。

　　3.8 錐形瓶：150、250mL。

　　3.9 容量瓶：100mL。

　　3.10 消煮管：250mL。

　　3.11 定氮儀：以凱氏原理制造的各類型半自動。

　　4、 試樣的選取和制備

　　選取具有代表性的試樣用四分法縮減至200g，粉碎后全部通過40目篩，裝于密封容器中，防止試樣成分的變化。

　　5 分析步驟

　　5.1.1 試樣的消煮

　　稱取試樣0.5～1g（含氮量5～80mg）準確至0.0002g，放入凱氏燒瓶中，加入6.4g混合催化劑，與試樣混合均勻，再加入12mL硫酸 和2粒玻璃珠，將 凱氏燒瓶置于電爐上加熱，開始小火，待樣品焦化，泡沫消失后，再加強火力 （360～410℃）直至呈透明的藍綠色，然后再繼續加熱，至少2h。

　　5.1.2 氨的蒸餾：

　　將試樣消煮液冷卻，加入20mL蒸餾水，轉入100mL容量瓶中，冷卻后用水稀釋至刻度，搖勻，做為試樣分解液。將半微量蒸餾裝置的冷凝管末端浸入裝有20mL硼酸吸收液和2滴混合指示劑的錐形瓶內。蒸汽發生器 的水中應加入甲基紅指示劑數滴，硫酸數滴，在蒸餾過程中保持此液為橙紅色，否則需補加硫酸。準確移取試樣分解液10～20mL注入蒸餾裝置的反應室中，用少量蒸餾水沖洗進樣入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL氫氧化鈉溶液，小心提起玻璃塞使之流入反應室，將玻璃塞塞好，且在入口處加水密封，防止漏氣。蒸餾4min降下錐形瓶使冷凝管末端離開吸收液面，再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均流入錐形瓶內，然后停止蒸餾。

　　5.1.2.3 蒸餾步驟的檢驗    精確稱取0.2g硫酸銨，代替試樣，按5.1.2步驟進行操作，測得硫酸銨含氮量為21.19±0.2％，否則應檢查加堿、蒸餾和滴定各步驟是否正確。

　　5.1.3 滴定    用5.1.2.1或5.1.2.2法蒸餾后的吸收液立即用0.1mol/L或0.02mol/L（4.6.2）鹽酸標準溶液滴定，溶液由藍綠色變成灰紅色為終點。

　　6 、空白測定    稱取蔗糖0.5g，代替試樣，按第5章進行空白測定，消耗0.1mol/L鹽酸標準溶液的體積不得超過0.2mL。消耗0.02mol/L鹽酸標準溶液體積不得超過0.3mL。

　　7、 分析結果的表述

　　7.1 計算見下式：

　　粗蛋白質（％）=（V2-V1）·c×0.0140×6.25/（m×V＇/V） ×100

　　式中：V2── 滴定試樣時所需標準酸溶液體積，mL；      V1── 滴定空白時所需標準酸溶液體積，mL；      c── 鹽酸標準溶液濃度，mol/L；      m── 試樣質量，g；       V── 試樣分解液總體積，mL；      V── 試樣分解液蒸餾用體積，mL；       0.0140── 與1.00mL鹽酸標準溶液〔c（HCl）=1.000mol/L〕相當的、以克表示的氮的質量。       6.25── 氮換算成蛋白質的平均系數。      7.2 重復性    每個試樣取兩個平行樣進行測定，以其算術平均值為結果。

　　當粗蛋白質含量在25％以上時，允許相對偏差為1％。

　　當粗蛋白含量在10％～25％之間時，允許相對偏差為2％。

　　當粗蛋白質含量在10％以下時，允許相對偏差為3％。